细胞RNA分提试剂盒

产品货号：

KL230823

中文名称：

细胞RNA分提试剂盒

英文名称：

Nuclear、Cytosolic & Organelle RNA Purification Kit

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

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真核细胞的RNA存在于三个部位，第一个部位是细胞核，主要是刚转录出来的各种RNA前体。第二个部位是细胞浆，主要是用做翻译模板的成熟mRNA、rRNA、tRNA和miRNA等。第三个部位是线粒体和叶绿体这些细胞器，它们有自己独立的RNA。在某些研究中，需要分部位纯化RNA。本制品就是专门满足此类需求的试剂盒。

采用专用膜裂解液，依次分离细胞浆、细胞器裂解液和细胞核三个组分，分别用于提取对应的RNA。
起始材料为培养的哺乳动物细胞，如HEK293、HeLa和HT1080，但不适用于实体组织和有细胞壁的真菌细胞和植物细胞。
基于异硫氰酸胍的沉淀法提取，RNA回收率高，基因组DNA污染少。
得到的RNA可直接用于RT-PCR、Northern杂交、cDNA合成等实验。

本试剂盒足够50次细胞浆RNA纯化、50次细胞器RNA纯化和50次细胞核RNA纯化。一次提取需要10⁶～10⁷个哺乳动物培养细胞。

组分	规格
细胞膜专用裂解液	20mL
细胞器专用裂解液	20mL
动物RNA提取液	250mL
CI混合液	50mL
核酸沉淀剂B型	150mL
RNA洗脱液	10mL

保存：室温，其中动物RNA提取液需置于4℃，有效期1年。

用户自备

PBS、胰酶溶液（0.25%胰酶、0.9mM EDTA）、75%乙醇。

使用方法

一、细胞的准备（本试剂盒不含本步相关试剂）

在直径10cm的培养皿（面积为55平方厘米）中培养贴壁细胞到80%融合度，去掉培养基，用常温自备PBS洗涤贴壁细胞。
加入0.8mL胰酶溶液处理（0.25%胰酶、0.9mM EDTA）37℃保温直到细胞分散（至少2分钟）。
加入5mL含10%胎牛血清的培养基终止胰酶消化，然后将细胞转移到离心管中。
4℃ 500×g离心10分钟，小心去上清液。
加入0.5mL预冷PBS重悬细胞并转移到1.5mL RNase-free离心管中。
4℃ 500×g离心10分钟，小心去上清液。

二、细胞浆裂解样本的准备

在细胞沉淀中加入400μL预冷的细胞膜专用裂解液。
在4℃冷室的脱色摇床上端对端摇晃10分钟以确保细胞膜完全裂解。
4℃ 2000×g离心10分钟。
小心将上清液均分到两个1.5mL RNase-free离心管中，分别加入1mL动物RNA提取液，涡旋震荡30秒，标记为细胞浆RNA，室温放置待用，与后面的细胞器裂解样本和细胞核裂解样本一起纯化。

三、细胞器裂解样本的准备

在上步的沉淀（含细胞核和细胞器）中加入400μL预冷的细胞器膜专用裂解液。
在4℃或冰上放置30分钟以确保细胞器膜完全裂解。
4℃ 7000×g离心10分钟。
小心将上清液（细胞器裂解液）均分到两个1.5mL RNase-free离心管中，分别加入1mL动物RNA提取液，涡旋震荡30秒，标记为细胞器RNA，室温放置待用，与后面的细胞核裂解样本一起纯化。

四、细胞核裂解样本的准备

在上步的沉淀（含细胞核）中加入1mL动物RNA提取液，涡旋震荡30秒，室温放置10分钟。离心管标记为细胞核RNA。
跟上面的两个样本共5管一起进入下一步操作。

五、RNA纯化

在装有裂解物-动物RNA提取液混合物的5个离心管中分别加入0.2mL CI混合液，振荡器上充分振荡混均30秒。
- 一定要把官底的溶液震荡起来，否则只是液面的振动。
14000g室温离心3分钟。
将上清液（约0.6mL）转移到另一干净的1.5mL塑料离心管中。下层有机相（蓝色）和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下50～100μL上清液不取。
在上清液中加入等体积的核酸沉淀液B型，振荡器上振荡30秒混匀。
14000g室温离心5分钟，离心底的侧面将形成RNA沉淀。
小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
在含RNA沉淀的离心管中加入1mL自备的75%乙醇，振荡混匀30秒。
14000g室温离心3分钟。
小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。
短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留乙醇(约50μL)，注意不要吸弃RNA沉淀。
- 此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的后续使用。
室温放1～2分钟后立即加入50～100μL RNA洗脱液使RNA沉淀溶解。千万不要用真空离心法使RNA沉淀过于干燥，否则RNA将变得十分难溶。
- RNA样品可以立即用于电泳、OD测定、RTR-PCR或存放于-80℃待用。

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